ナノ生命科学研究所のLeonardo Puppulin特任助教（研究当時），ナノ生命科学研究所／新学術創成研究機構の柴田幹大教授，東京大学先端科学技術研究センターの西増弘志教授らの共同研究グループは，高速原子間力顕微鏡（高速AFM）（※1）を用いて，黄色ブドウ球菌由来の小型CRISPR-Cas9（※2），SaCas9がDNAを切断する瞬間を動画として撮影することに成功しました。
近年，標的DNA切断による「ゲノム編集」（※3）技術は，生命科学に革命をもたらしました。特に，細菌がもつDNA切断酵素CRISPR-Cas9を応用したゲノム編集技術は，基礎研究から臨床研究まで多岐に渡る生命科学分野において広く利用されています。しかしながら，意図しないDNA配列の編集（オフターゲット）が，Cas9のより広い使用に向けて依然として大きな制限となっており，Cas9によるDNA探索・結合・切断のダイナミクスを完全に理解することは，ゲノム編集の安全性を高めるために極めて重要と考えられています。今回，本研究グループは，黄色ブドウ球菌由来の小型CRISPR-Cas9, SaCas9の観察に高速AFMを用い，RNA結合状態において，開いた構造と閉じた構造を遷移する様子や，SaCas9がDNA切断後すぐにDNAから離れる様子をリアルタイムで可視化することに成功しました。
当研究グループは，2017年にもCas9の中で最も有名なSpCas9のDNA切断過程の動画撮影にも成功しており，さまざまなゲノム編集ツールの網羅的な解析を進めています。これまでの研究成果と合わせて，本研究成果はCas9のDNA切断分子作動メカニズムの深い理解につながり，ゲノム編集技術のさらなる高度化を目指した基盤研究となることが期待されます。
本研究成果は，2023年2月27日（米国東部時間）に米国科学誌『ACS Nano』にオンライン掲載されました。
図1：SaCas9のドメイン構造（上）と結晶構造（下）
SaCas9はいくつかの部分（ドメイン）から構成される。HNHおよびRuvCと呼ばれるドメインが「ハサミ」としてはたらき，二本鎖DNAを切断する。
図2：SaCas9単体の高速AFM動画
図3：SaCas9-RNA複合体の高速AFM動画
図4：SaCas9-RNA-DNA複合体の結晶構造（左）と高速AFM画像（右）の比較
図5：SaCas9-RNA-DNA複合体のDNA切断時の高速AFM画像
【用語解説】
※1：高速原子間力顕微鏡（高速AFM）
柔らかい板バネの先に付いた針の先端で試料に触れ，試料の表面形状を可視化する顕微鏡。針と試料の水平方向の相対位置を変えながら試料表面の高さを計測することにより，試料の表面形状を可視化する。また，試料の表面を高速（最速33フレーム/秒）にスキャンすることにより試料の動きを可視化することができる。
※2： CRISPR-Cas9
微生物のもつ獲得免疫機構の一つひとつ。CRISPR-Cas系において，Cas9はガイドRNAと結合し，ガイドRNAの一部（20塩基のガイド配列）と相補的なDNAを選択的に切断する。ガイド配列を変更することにより，さまざまな塩基配列をもつDNAを選択的に切断することができる。Cas9-RNA複合体をCRISPR-Cas9と呼ぶこともある。
※3：ゲノム編集
生命の設計図であるゲノムDNAの塩基配列を改変する技術。CRISPR-Cas9（clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated proteins）を利用することにより効率的なゲノム編集が可能になった。
ジャーナル名：ACS Nano
研究者情報：柴田幹大
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